Golden Gate アッセンブリーをシミュレーション

SnapGene 6.1より Golden Gate アッセンブリーのシミュレーション機能が追加されました。

Golden Gate アッセンブリーは Type IIS 制限酵素を用いたクローニング方法で、余分な配列を含まずシームレスにクローニングを行うことが可能です。このチュートリアルでは、SnapGeneで Golden Gate アッセンブリーをシミュレーションする方法をご紹介します。

目次

1. 【準備】DNA配列を入手する
1. データをインポートする
2. Golden Gate アッセンブリーをシミュレーション
   1. 断片タブ
   2. 産物タブ
   3. 履歴ビュー

1.【準備】DNA配列を入手する

SnapGeneは、NCBI や Addgene のデータベースから配列をインポートすることが可能です。このチュートリアルでは、SnapGeneオンラインシークエンスから pGGASelect をインポートしてデータを読み込みます。

また、本チュートリアルで使用する YIplac211-TPM1-msGFP.dna のファイルはこちらよりダウンロード可能です。

YIplac211-TPM1-msGFP.dna

1-1. データをインポートする

SnapGeneを起動し、「インポート」から「SnapGene オンラインシークエンス」を選択します。

ダイアログの検索フィールドに pGGASelect と入力し検索を開始します。検索結果に表示された pGGASelect を選択し、「インポート」ボタンをクリックします。

ファイルの読み込みが完了と同時にファイルが開きます。

2. Golden Gate アッセンブリーをシミュレーション

ツールバーの 「アクション」 → 「Golden Gate アッセンブリー」 → 「断片を挿入…」 をクリックし、作業ウィンドウを開きます。

1pGGASelect のベクターが選択されています。もし、pGGASelect が選択されていない場合は、ドロップダウンリストから選択してください。

2デフォルトでは、Type IIS 制限酵素として BsaI が選択されています。別のタイプIIS制限酵素を使用する場合は、ドロップダウンリストから変更してください。 ファイルをダウンロードしても SnapGene で読み込んでいない場合、ドロップダウンリストには表示されません。リストに表示されない場合、ドロップダウンリストの一番下にある「ブラウズ...」からファイルを指定し開きます。

3インサートして置換する領域が自動的に選択されます。

4ベクターの向きを変更する場合は「ベクターの配向」で指定します。

2-1. 断片タブ

断片タブに切り替えます。ソースファイル（YIplac211-TPM1-msGFP.dna) をドラッグ&ドロップするか、「断片のソース」のドロップダウンから、ファイルを選択します。

マップビューで、クローンを作成するフィーチャー（ここでは、msGFP）をクリックして選択します。または、シークエンスビューに切り替えて挿入する領域を選択します。

2-2. 産物タブ

産物タブを開き、「PCRプライマーを選択...」をクリックします。

使用しているPCR酵素に応じてプライマーのTm値を設定し、Type IISサイトの 5' に追加する塩基の数を設定します。設定が終わったら、「プライマーを選択します」をクリックします。

産物タブにクローニング後のプラスミドマップが作成されます。

新たに作成されたPCRプライマーはデフォルトで「断片.FOR」「断片.REV」と名付けられます。断片タブに切り替えて、新たに作成したプライマーに名前を変更します。

シークエンスビューでクローニング後の配列を確認したり、プライマービューで実際に使用するプライマーの配列を確認します。問題がなければ、右下の「産物作成」で任意のファイル名（今回は “pGGAselect-msGFP” ）を付けて「アセンブル」をクリックします。

直鎖状ベクターや断片のファイルを作成する場合は、「ファイル作成」にチェックを入れ任意のファイル名をつけて下さい。

2-3. 履歴ビュー

履歴ビューで Golden Gate アッセンブリーの過程を確認できます。