非線形回帰チュートリアル

非線形回帰とは

よくある誤解

データを入力すれば自動的にシグモイド曲線を生成し、IC/EC50値を算出してくれる？

いいえ。正しいモデルに正しいデータを入力して初めて算出できます。いずれかが間違っていれば、それは価値のない間違った値です。

どんなデータでもフィットできる？

いいえ。できません。

データの単位や形式を気にする必要はない？

いいえ。あります。

最適合値が出力されたモデル式が、そのデータの反応式？

いいえ。解析者が妥当なモデル式を選択して最適合値を算出します。解釈が逆です。

モデル式の選択を気にする必要はない？

いいえ。常に気にする必要があります。

フィットのモデル式は自動的に生成される？

いいえ。自動的には生成されません。自動生成させる仕組みを作ることはできますが、選ばれたモデル式の妥当性は解析者が判断することです。GraphPad Prismでは、モデルの自動生成は採用していません。

最適合値として出力された値の信頼性はどれも同じ？

いいえ。正しいモデル式のもとで計算した場合の最適合値であっても、信頼区間の広さで信頼性は変わります。

Excelのグラフ機能で線を滑らかにすればモデルフィッティングになる？

いいえ。それは、たいていの場合、単にスムージング（平滑化）してデータを見やすくしただけです。モデルについてはこだわりがなく、考察できるような最適合値が必要ないならば、これで事足りる場合もあります。つまり、解析者の目的によります。
本資料ではこれらのことも交えながら、非線形回帰について説明していきます。

なぜ非線形回帰分析を使うのか

研究者が示したい反応メカニズム（モデル）が、多くの場合本質的に非線形だからです。

反応のメカニズムはモデルで表現され、モデルの項（パラメータ）が積の関係にある場合、非線形の関係にあることに相当します。 実験により得られたデータをモデルにあてはめて、誤差が最小になるように、最適な解（パラメータ推定値）を得ることが回帰分析です。これは線形、非線形とも同じ理論に基づいています。線形式は解析的に解けますが、非線形式の場合は数値的に解く必要があることだけが異なります。分析を行う研究者は、この違いの本質について詳しく知る必要はありません。

GraphPad Prism を使えば医薬品研究、臨床研究で用いるモデルの多くがビルトインされており、線形回帰と非線形回帰のどちらを使うかで迷う必要は全くありません。

パーソナルコンピューター（PC）が広く普及していなかった時代（およそ1995年以前）は、例えば50％効果量を示す場合、最小反応を0、最大反応を100に基準化し、直線的に反応する濃度範囲で直線回帰を行うことが一般的に行われていました。なぜならば、非線形式を数値的に解く手間が膨大であり、実験の合間にできるような作業量ではなかったからです。しかし、PCが高度に発達した現代では非線形式をダイレクトに算出することが当たり前で、計算は瞬時に終わります。線形モデルに近似して最適解を求める方がずっと手間がかかるだけでなく、推定精度が非線形に比べて劣るため、線形モデルを選ぶ必要はありません。

どのようなときに使うのか

非線形回帰が使われるのは、以下のような場合です。

• 薬物の反応メカニズムを証明するとき
• 薬物の反応（効力・効果量:potency、最大反応効果:efficacyなど）を定量的に示すとき
• 反応の最大Maxや、50％阻害濃度IC50、酵素阻害定数Ki、反応のレンジ（濃度幅）を表すHill係数などを求めるとき

GraphPad Prism で得られたこれらの係数は最適合値（Best-fit value）として出力されます。一般にはパラメータ推定値（Parameter estimate）と呼ばれており、これらは同一のものです。

信頼区間の重要性

GraphPad Prism では、最適合値の推定精度を表す信頼区間も同時に推定します。

メカニズムの証明の際、最適合値の推定精度の情報は重要です。科学論文に原稿を提出する場合、規制当局に結果を報告する場合のほとんどにおいて最適合値の推定精度を表す指標として標準誤差あるいは信頼区間（実験を繰り返したときに、その範囲に入る確率）を併記するよう求められます。最適合値は信頼区間と共に示すようにしてください。データを取得した研究者（あるいはその研究者が所属する組織の長）が信頼区間を不要だと思っていても、結果を評価する立場の第三者（QA担当者、査察官、査読者）は最適合値だけで納得する場合は稀です。なぜならば、推定精度が示されない推定値にどの程度の信頼性があるのか、分からないからです。

新たなメカニズムの薬物等の薬物特性等を論文投稿した際、最適合値の信頼区間がないために、査読者からリバイス指示を出されるケースは多いです。リバイスに応じない場合、論文はリジェクトされることがあるため、最初から論文中に最適合値とともに信頼区間を示すことをお勧めします。 ただし、既にメカニズムが分かっている複数の薬物の薬効プロファイリング試験等ではIC50のみのパネル表示や、データとシグモイドカーブ表示が適している場合もあります。どの推定値をどのように示したらよいかについては、その科学（医学、薬理学等）に精通した研究者の判断とセンスにより決定することであり、統計学的側面から決められるものではありません。

得られたデータを見やすくするためにデータをつなぐ線をスムージングしたい場合があるかもしれません。スムージングに使われる関数は統計学的に線形の場合（多項式）、非線形（スプライン関数等）の場合の両方があります。GraphPad Prismはこれらのフィッティング機能を搭載しています。ただし、気を付けたいのは、スムージングはいわゆる回帰分析＝何か特定のメカニズムを想定したモデル解析とは別のものです。Excelのグラフ機能で滑らかな曲線を描く機能や分析ツールの移動平均の機能もそれにあたります。

非線形回帰で何が分かるのか

薬理メカニズムに従った反応であるかが示唆でき、そのメカニズムに基づいた最適合値（EC50、Ki、Kmなど）とその推定精度（信頼区間）が計算できます。

想定した薬理メカニズムに従った反応であれば、モデルにフィット＝妥当な最適合値が計算されるはずです。モデルにフィットしない場合は、何らかの想定外の事象を介した反応、すなわちアーティファクトを捉えている可能性があります。

線形回帰が有用な場合

線形回帰が有用なのは以下の場合です。

• 酵素阻害剤の阻害様式を検討するとき
  
• 実験に利用できる基質量や薬物量が限られており、直線領域でしか検討できないとき
• 薬物の作用メカニズムを含めた検討が不要なとき（スクリーニング）

阻害剤の濃度、基質の濃度を変えて、実験を行い、逆数変換した値を線形にフィットさせ、その形状から阻害様式を検討します。 理論的に実験誤差が歪むことが知られており、回帰の推定精度が極端に低下することが知られています。そのため、推定値を算出する際に逆数変換した値と線形モデルを用いて最適合値を計算すべきではありません。

近年、評価系の感度の向上、ロボット技術の向上により、小サンプルで高速な実験（ハイスループットスクリーニング）が可能になってきました。この場合、十分なデータポイントを検討できるため、線形回帰をあえて使う必要はありません

非線形回帰は線形回帰と何が違うのか

線形、非線形ともに同じ理論（最小二乗法）に基づいて最適合値を求めます。線形式は解析的に解けますが、非線形式の場合は数値的に解く必要があることだけが違います。また、ソフトウェア内部では、どちらも数値的に解いています。GraphPad Prismが採用しているアルゴリズムの詳細は GraphPad Software 社のオンラインガイド Comparing linear regression to nonlinear regression または フィッティングガイド^*（ 第3章カーブフィッテイングの原理 > 3.単回帰の原理：線形回帰と非線形回帰の比較）を参照ください。

線形回帰ではEC50を示すことはできても、反応の最大や傾き（反応する濃度幅）を定量化することはできません。 逆数変換等を行って線形回帰で推定すると、分散が歪み、信頼性に乏しいことが理論的に知られています。フィッティングしにくいデータを線形変換し、線形回帰を行うと、最適合値にバイアスが入ることも懸念されます。

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GraphPad Prismでの非線形回帰の留意点

プロファイル尤度法による信頼区間の算出

信頼区間がプロファイル尤度法（正確な方法）で算出されます。詳細はヘルプから確認できます。しかし、統計学の研究者を除けば、導出法の詳細を理解する必要はありません。

GraphPad Prism7 以前は近似法（Wald法）で算出されていました。データが少ないとき（主にデータポイントが少なくかつモデルへの当てはまりが良くない場合）、プロファイル尤度法での信頼区間が計算できない場合があります。 その際は、近似法を使うことも可能です。現在でも近似法は多く用いられます。ただし、データを取得してから手法を切り替えるのは望ましいことではありません。本番のデータを取得する前に、条件検討しておくことが望ましいです。また、GraphPad Prism7 以前から、同じ薬物を近似法で計算している場合は、整合性をとるために、どちらかに統一しておいた方がよいでしょう。

近似法の使用方法

実数モデル、対数モデルの両方がある

対数用量モデルの場合は、薬物の用量は対数値で与える必要があります。誤って実数用量で与えた場合でも、Prism でグラフ化する際、あたかもS字曲線が描画されることがあります。

しかし、結果をみると、最適合値がデータとかけ離れたおかしな値となっており、95％信頼区間が異常に広い範囲をとります。

Prism10では、結果タブ内に示されるノートには、この結果にはおそらく意味がないと表示され、修正方法が示されます。Prism8.1以前では、フィットに”不明確/ambiguous”と記載して、値は信頼性が無いことを示すために、波形符号(~)を最適合値の前に付け、その信頼区間を表示しない仕様（信頼区間タブの不安定なパラメータと不明確なフィットの部分）でした。

誤ったモデル（Xは実数なのに対数モデル）で行った解析

Xを対数用量（Log10）に変換した後の解析

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^** X値を対数に変換する方法は以下の通りです。