SnapGene
SnapGeneラーニング:制限酵素処理によるクローニング
製品トライアル版SnapGene Viewer

  

制限酵素処理による挿入クローニング

制限酵素でインサートとベクターの切断・開環し、DNAリガーゼを使ってライゲーションを行うクローニングは最も一般的に行われている方法です。 SnapGeneでは、使用する制限酵素の選択からクローニング後のイメージまで、制限酵素とライゲーションによるクローニングのシミュレーションを簡単に行うことができます。またプロトコルに設計上の欠陥がある場合、そのエラーを発見して修正する機能も備えています。

このチュートリアルでは、一般的なクローニング法(制限酵素処理による挿入クローニング)をシミュレーションする方法をご紹介します。

1.【準備】DNA配列を入手する

本チュートリアルでは、A型インフルエンザウイルスの第8分節の配列と pcDNA3.1+/C-Myc を使用します。

1-1. ファイルの読み込み(Influenza A virus seg.8 配列)

SnapGene を起動して、「新しい DNA または RNA ファイル」を選択します。すでにSnapGeneを起動している場合は、メニューバーの 「ファイル」 →「 新しい DNA または RNA ファイル 」 から選択します。

SnapGene_新しいDNAまたはRNAファイル

SnapGene起動時ダイアログ

SnapGene_新しいDNAまたはRNAファイル_メニューバー

SnapGene メニューバー

下記ページよりA型インフルエンザウイルスの第8分節の配列を取得し、コピー&ペーストで読み込みます。

Influenza A virus (A/New York/392/2004(H3N2)) segment 8, complete sequence
www.ncbi.nlm.nih.gov
上記 NCBI のリンク先にアクセスできない場合、下記よりテキストファイルをダウンロードしてご利用ください。
NC_007370.txt
SnapGene_配列のコピー
www.ncbi.nlm.nih.gov
SnapGene_DNAまたはRNAファイル

次にメニューバーの 「プライマー」 →「 プライマー追加 」を選択し、以下のプライマーを追加しましょう。

  • EcoRI-IAV-NS1-Fw:CTCGAATTCATGGATTCCAACACTGTGTCAA
  • XhoI-IAV-NS1-Rv:GCGCTCGAGTTATCAAACTTTTGACCTAGCTGTTCT

プライマーを追加後、PCRのシミュレーションを行います。メニューバーの「アクション」 →「PCR」を選択し増幅産物として “EcoRI_IAV-NS1_XhoI.dna” を作成・保存してください。

SnapGene_PCR

1-2. ファイルの読み込み(pcDNA3.1+/C-Myc)

続いて、pcDNA3.1+/C-Myc を読み込みます。

ツールバーの「ファイル」→「インポート」→「SnapGeneオンラインシークエンス」を選びます。検索フィールドに “pcDNA3.1+/C-Myc” と入力し、ヒットした該当するオンラインシークエンスをインポートします。

「インポート」ボタンがアクティブ化されていない場合は、検索結果として表示された “pcDNA3.1+/C-Myc” をクリックして下さい。ボタンがアクティブ状態になります。

SnapGene_オンラインシークエンスのインポート1
SnapGene_オンラインシークエンスのインポート2

2. 制限酵素処理による挿入クローニング

本チュートリアルでは、pcDNA3.1+/C-Myc と PCRで増幅した EcoRI_IAV-NS1_XhoI を制限酵素(EcoRI と XhoI)で処理し、IAV-NS1をpcDNA3.1+/C-Myc にクローニングするという流れをシミュレーションします。

pcDNA3.1+/C-Myc の画面で、ツールバーの「アクション」から「制限酵素と挿入クローニング」「断片を挿入」へと進みます。

SnapGene_制限酵素と挿入クローニング_断片を挿入

Ctrl または Shift を押しながら、制限酵素の EcoRI と XhoI を選びます。

SnapGene_制限酵素と挿入をクローニング_ベクター

次に「断片」タブに切り替え、右側の「断片のソース」のドロップダウンリストから “EcoRI_IAV-NS1_XhoI.dna” を選びます。

SnapGene_制限酵素と挿入をクローニング_断片

断片のソースを選択後、 制限酵素切を選択します。マップ上で Ctrl()/ shift()を押しながら、 EcoRI と XholI をクリックして選択します。

SnapGene_制限酵素と挿入をクローニング_断片_制限酵素の選択

最後に「産物」タブに切り替えて、クローニング後のプラスミドマップを確認します。インサートは赤で、ベクターは黒で表示されています。 “pcDNA3.1-IAV-NS1-Myc.dna” と名前を付けて、「クローン」ボタンをクリックします。

SnapGene_制限酵素と挿入をクローニング_産物

新しく開いた pcDNA3.1-IAV-NS1-Myc.dna の履歴ビューで、PCRからクローニングまでのシミュレーション履歴を見ることができます。

SnapGene_PCRからクローニングまでの履歴

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