SnapGene
SnapGeneラーニング:Gibson Assembly®
製品トライアル版SnapGene Viewer

  

Gibson Assembly®

Gibson Assembly®は、制限酵素を使わずに目的断片をプラスミドにクローニングする方法です。Gibson Assemblyでは、DNA(フラグメント、ベクター)をPCRで増幅し、その末端にオーバーラップする領域を作ります。少々複雑ですが、SnapGeneを使えば、この方法を可視化することができます。

Gibson Assemblyで必要なプライマーも自動で設計できます。あなたは結合したいDNAフラグメントを選択するだけで、SnapGeneが適切なプライマーを自動設計します。

このチュートリアルでは、Gibson Assembly(制限酵素を使わずにプラスミドを構築する方法の1つ)をシミュレーションする方法をご紹介します。

1.【準備】DNA配列を入手する

本チュートリアルでは、lentiCas9-EGFP と pTurboRFP-PRL を使用します。それぞれのファイルをダウンロードしておきましょう。

lentiCas9-EGFP Sequence and Map
Zhang lab lentiviral vector for expressing human codon-optimized S. pyogenes Cas9 plus enhanced GFP (EGFP).

www.snapgene.com
pTurboRFP-PRL Sequence and Map
Promoterless TurboRFP reporter vector.

www.snapgene.com

2. Gibson Assembly®をシミュレーション

本チュートリアルでは、lentiCas9-EGFP の EGFP を pTurboRFP-PRL の RFP と入れ替えることを想定して、Gibson Assemblyのシミュレーションを行います。

lentiCas9-EGFP のプラスミドマップを開き、ツールバーの「アクション(A)」から「Gibson Assembly®」「断片を挿入(F)」へと進みます。

Gibson Assembly_ギブソン・アセンブリ_img1

入れ替えたい領域(今回はEGFP)を選択した状態で、断片タブに切り替えます。

Gibson Assembly_ギブソン・アセンブリ_img2_断片タブ

そして、右側のドロップダウンリストから “pTurboRFP-PRL” を選びます。 次に、pTurboRFP-PRLのプラスミドマップ上で入れ替えたい領域(今回はRFP)を選択します。もし入れ替えたい領域の向きも変えたいときは、「断片の配向」を変更しましょう。

Gibson Assembly_ギブソン・アセンブリ_img3

産物タブに切り替えて、「オーバーラップしているPCRプライマーを選択」をクリックします。

Gibson Assembly_ギブソン・アセンブリ_img4

設定画面が出てきたら、使用するPCR酵素に合わせてTm値を設定しましょう。また使用するGibson Assemblyのキットに合わせて、末端部のオーバーラップしている塩基数を設定します。設定が終わったら、「プライマーを選択します」をクリックしましょう。

Gibson Assembly_ギブソン・アセンブリ_オーバーラップしているPCRプライマー

lentiCas9-EGFP の EGFP が RFP に入れ替わっているのを確認します。問題が無ければ、右下の「産物作成」で名前を付けましょう(今回は “lentiCas9-TurboRFP” )。「アセンブル」をクリックすると新規ファイルが立ち上がるので、プライマータブで必要なプライマーの詳細を確認しましょう。履歴タブでは、Gibson Assemblyの記録が確認できます。

Gibson Assembly_ギブソン・アセンブリ_img5

チュートリアルで紹介した機能や操作方法に関するお問い合わせはお問合せフォームよりお願いします。